类型I已知基因的序列

（1）已知DNA序列，包括三种情况，一是已知目的基因的DNA全部或部分DNA序列（与题目要求略有出入）；二是已知其它物种的同类基因的DNA序列（功能可能已知，与题目要求略有出入）；三是已知目的基因cDNA全部或部分序列（属于题目要求已达到的类型）。

（2）已知目的基因表达产物蛋白等序列。

在这两种情况下一般采用PCR技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。

类型II已有基因图位或标记，转座子等条件，分别可采用转座子标签法、T-DNA标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。

类型III为止目的基因序列

（1）差异表达序列，即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术，定向引物扩增技术和DDRT-PCR、SSH-PCR、RAP-PCR、DNA-RDA、cDNA捕捉法等进行克隆。

（2）无差异表达的目的基因，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测须发等进行，是难度较大较繁琐的策略。

从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类：一种类型是功能克隆，即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。从cDNA 文库或基因组文库中调取目的基因。第二种类型是表型克隆。是近年来发展十分迅速的一类方法，例如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）抑制型差减杂交（SSH）等。第三类是无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆。

代表性差示分析（RAD）充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。将待测cDNA (Tester)和驱动cDNA (Driver)分别用同一种识别4碱基序列的限制性内切酶切割，形成的平均长度为256bp的cDNA片段代表群，保证了绝大多数遗传信息均能被ＰＣＲ扩增；分别接上寡聚核苷酸接头(adaptor)，并以接头为引物进行PCR扩增，此步将大小不等的DNA片段分离纯化；将接头切除，并只在Tester 片断末端接上新接头，然后将Tester与大大过量的Driver混合杂交。Driver过量的目的是使Ｔ群体中特异性序列没有遗漏的可能；复性，补平末端，并以新接头为引物进行ＰＣＲ扩增，形成的3种杂和体中只有自身退火形成的Tester / Tester两端均能和引物配对，产物双链ＤＮＡ数量呈指数递增。Tester / Driver杂交体只能是单引物扩增，产物为单链ＤＮＡ分子，其数量呈线性递增。Driver/ Driver杂和体由于分子两端没有与新引物配对区而无法进行扩增；用Mung Bean Nuclease去除单链DNA分子，差异双链cDNA便完成第一轮富集。实验中使用过量Driver DNA目的是充分使Tester DNA中和Driver DNA序列相同的片段杂交，酶解去除，只有差异双链差异cDNA经PCR几轮循环得以有效富集。

代表性差示分析（RAD）优点可以概括为以下几个方面：
（1）引物设计十分巧妙
（2）可重复性好
（3）假阳性少
（4）mRNA用量少、特异性高
其缺点为：
（1）Tester组低丰度的分子自身杂交的几率很低，所以被扩增和克隆的几率仍很低；
（2）酶切连接步骤太多，cDNA会损失很多，所以可能漏掉关键基因；
（3）得到的不是cDNA全长而是其酶切片段。