基因克隆技术的三种策略
第一版 什么是基因克隆技术

　　基因是细胞内染色体上具有遗传效应的DNA分子片段，克隆技术（Cloning）指由众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择，获得目的基因或细胞的技术操作。基因克隆（gene cloning）是指某种目的基因的分离过程，通常是从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA片段，再通过DNA 序列扩增形成由众多拷贝组成的DNA拷贝群体的过程。
　
　　基因克隆的策略大致可分为表型克隆(phenotypic cloning)、定位克隆(positional cloning)和侯选定位克隆(candidate positional cloning)三种。表型克隆利用病变组织与正常组织DNA或RNA水平上的差异，进行疾病相关基因的分离与克隆，由于直接联系疾病的表型与基因，故称为表型克隆；定位克隆首先是获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆；侯选定位克隆是对定位克隆的改进，该方法首先将致病基因定位到某一染色体区域，然后再找出区域内的所有基因，根据这些基因的生化特性、表达时空特异性、功能结构域等筛选与疾病相关的侯选基因，从中确定致病基因。三种策略各有各的特点，下面分别进行介绍。

第二版 表型克隆

　　表型克隆策略不依赖于基因的染色体位置或基因的产物信息，只从疾病的特征出发，比较疾病DNA与正常DNA水平的差异，并直接对变异的DNA进行分离。该方法是疾病基因克隆中的一种新策略，它的特点是既不考虑基因的功能线索，也不考虑基因在染色体上的位置信息，而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上的差异，联系疾病的表型与基因，故又称为表型克隆。

　　在真核生物中，从个体的生命活动、组织的分化、凋亡到细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。生物体内任意细胞中得以表达的基因不足10%，而这些基因的表按时间和空间顺序有序进行的，此即为基因的差异表达。生物体表现出的各种特性，主要是由基因的差异表达引起的。

　　表型克隆研究的主要技术方法有差异显示PCR (differential-display PCR, DDPCR)、基因组错配扫描 (genome mismatch scanning, GMS)、代表性差异分析(representative difference analysis, RDA) 和抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)等。

第三版 定位克隆

　　定位克隆的总体思路是：疾病→染色体定位→基因序列→mRNA／cDNA→蛋白质 (致病基因表达产物)。通过分析患病家系的连锁关系来确定致病基因的遗传方式，从染色体畸变引发的疾病入手，将染色体畸变的位置作为疾病基因克隆的一个位点进行分析。若发现某种疾病与染色体变异直接相关，致病基因就可定位在一段相对较短的染色体变异区域，由连锁分析将基因分离的目标初步定位在 10～20Mb区段内，使要分离的目标基因大大缩小，再通过筛选DNA文库、外显子捕获 (exon trapping)和比较基因组杂交(comparative genome hybridizatien)等表型策略获得致病基因。

　　在基因组内尚无足够多态性位点提供某一疾病的连锁信息时，定位克隆不失为一种有效的致病基因克隆策略。因此，利用染色体畸变克隆致病基因是早期研究致病基因的重要手段之一。随着人类基因组遗传图谱和物理图谱的完成，人们可有效地利用图谱标记确定与疾病性状的连锁关系，进行基因定位克隆。

第四版 定位侯选克隆

　　定位候选克隆是定位克隆的一种改进方法，被认为是最有发展前途的基因定位策略。人类基因组草图问世之后，所有人类致病基因将很快被定位在染色体的某个区域，利用数据库查找定位于此区域的所有已克隆的基因或cDNA，筛选染色体上与致病基因相关的可能位置，从中克隆出相关的致病基因，再对其编码蛋白质进行功能分析并与相应的症状做比较，找出可能的候选致病基因，然后对患者的染色体进行细胞学检查，利用突变基因动物模型与疾病的一致性，最终确定该候选基因是否是致病基因。这就是定位候选克隆。

　　定位候选克隆包括基因组定位、候选cDNA的获得、全长cDNA及功能分析三个基本步骤：

（一）基因组定位

　　常采用PCR法、FISH技术、染色体显微切割和辐射图谱等方法，筛选疾病基因的基因组杂合性丢失(loss of heterozygosity， LOH)高频率区，进而对致病基因进行定位候选克隆。例如，体细胞抑癌基因的失活是导致细胞癌变的一个主要因素，最常见的表现是杂合性缺失。通常在染色体杂合性缺失的高发频率区含有一个或多个抑癌基因，用PCR检测肿瘤样本染色体各区带的缺失情况，可以确定LOH的高发频率区，也即确定了相关肿瘤生长负调控因子的染色体定位，下一步可作基因的克隆工作。

（二）cDNA的获得

　　基因组定位提供的信息包含一定的分子标记，可用 PCR或杂交的方法直接从YAC(yeast artificial chromosome)库、或BAC(bacterial artificial chromosome)库、PAC(P1 artificial chromosome)库中筛选相对应的克隆。目前YAC库已逐步为PAC库和BAC库取代。PAC系统是以噬菌体P1为基础的克隆系统，它可容纳 70～100kb的插入片段，并可选择性地区分重组子和非重组子，而且同时有两套复制机制。BAC系统是由大肠杆菌F因子衍生而来的载体系统，可容纳超过 100kb的插入片段，其主要优点是稳定性好、操作简单。由这些克隆入手，采用依赖cDNA文库的方法、依赖特征序列的方法或依赖表达性质等方法获得候选 cDNA。

　　上述方法各有优缺点，实验时应根据原材料及实验目的，选择适当的方法或方法组合进行。此外，还有其它方法，如微切割和微克隆法、减法cDNA杂交法、重组筛选法等。随着区域性基因图谱的构建和标记位点的增多，从相互重叠的克隆群中筛选候选cDNA，也即筛选致病基因的表达序列和基因定位的步伐将会大大加快。

（三）全长及功能分析　　

　　获得了众多候选cDNA后，通过筛选cDNA文库或cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends , RACE）等方法克隆全长基因。cDNA末端快速扩增技术是一种基于PCR的技术，它的发展大大便利了应用其它方法获得部分cDNA序列后克隆全长 cDNA 5'和3'末端的工作，能在短时间内得到完整的cDNA末端序列。

　　为确定全长基因中的致病基因，需要逐一检测它们在患病家系中的变化，并分析其功能。由于不同的疾病特征不同，需要用不同的功能检测系统来分析，所以功能分析往往成为定位侯选克隆中的一个难点。最近发展出了一些与其它方法相结合的新思路，例如与差减杂交相结合，筛选位于候选区域的差异表达基因，大大增加了获得有价值基因的可能性。随着人类基因组计划中转录图谱工作的进展，越来越多的EST被精确定位于染色体的不同区带，可以直接进行功能研究。同时，随着EST定位工作的逐步完成，基因转录图谱不断完善，完全可能跳过定位克隆的第二个步骤而直接进入功能鉴定和基因全长的克隆工作，这也许是定位克隆中最快的方法。