最常用的Cas9直系同源物SpCas9利用了在5′末端包含20个核苷酸(nt)与靶DNA位点“前间隔序列”（ protospacer）区域互补的crRNA。crRNA和tracrRNA通常结合成大约100-nt的单导向RNA (gRNA)，指导SpCas9的DNA切割活性。
具有17或18个核苷酸的截短的gRNA可以减少脱靶效应而不损害切割效率。可尝试使用截断的protospacer来增加实验的特异性。你也可以通过使用成对的Cas9切口酶引入插入缺失来减少脱靶效应。