RNA干扰是由长链型、完全型或不完全型双链RNA激活的，这些双链RNA被识别并被一种叫做“Dicer”（切割器）或者“DCL” (切割器形) 的RNA酶III进行特异性剪切，得到21–26个核苷酸的小型双链。然后这些小型双链RNA以单链RNA的形式被识别、解链和重组为RISC (RNA诱导沉默蛋白复合体)，在此他们直接由Argonaute 家族的蛋白质通过序列互补、剪切或翻译表达为靶标信使RNA。
第一，微小RNA 起源于明显不同于其他识别基因的基因位点，而小型干扰RNA通常起源于信使RNA、转座子、病毒 或异染色质的 DNA。
第二，微小RNA由能形成局部RNA 发夹结构的转录体加工而成，而小型干扰RNA 由长链双分子RNA双链体或拓展发夹结构加工而成。
再次， 单个“微小RNA：微小RNA”双链体起源于每个微小RNA发夹结构的前体分子, 而小型干扰RNA 双链体集合体起源于每个小型干扰RNA前体分子，导致了许多不同的小型干扰RNA在这种拓展型的双链RNA的双链上聚合。
第四，相关生物中的微小RNA序列几乎总是保守的，而外源小型干扰RNA 序列很少是保守。
第五，关于微小RNA 和外源小型干扰RNA的生物靶标方面，外源小型干扰RNA是典型的 “自动沉默”，也就是它们在其起源的同一位点(或非常相似的位点)沉默，而微小RNA 是“异位沉默”，也就是它们是由具备非常不同的沉默的基因产生的。