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knockout,gene knock-out
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基因敲除,基因剔除

分类:分子生物学          |    查看相关文献(pubmed)   |    免费全文文献

详细解释:

当基因转入破坏生物体基因组内某个基因后,观察由此引起的表型变化,同样也可认识基因的功能,这是基因剔除(gene knock-out)。基因剔除是用DNA重组技术剔除或破坏生物体基因组内某一特定基因,而后观察由此引起的表型改变。这样,可以了解该基因的生物学功能。现以小鼠为例,先将待剔除的基因制成缺失突变型,在缺失的位置上插入一个选择基因如新霉素抗性基因(neo),同时再接上另一个选择基因如胸苷激酶基因(tk)。将这一段带有已失去原有功能的待剔除基因的DNA片段装在载体上,转入在体外培养的小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)。在细胞内,通过同源重组将基因组里有功能的待剔除基因置换掉,也就是被剔除了。因为转入的外源DNA片段只有通过同源重组整合进基因组时,方能把片段上连接在待剔除基因旁边的选择基因丢掉。非同源重组也就是随机整合,则会把整个外源DNA片段包括已失去功能的待剔除基因序列和两个选择基因,全部插入ES细胞的基因组。此时,在体外培养ES细胞时,在培养液里加入针对两个选择基因的适当的化学物质,就可使随机整合(此时整个外源DNA包括neo和tk基因都被整合)而仍保留着待剔除基因的ES细胞被选择性地杀死;只有发生了同源重组(此时,tk基因不被整合)使待剔除基因被置换或剔除掉的ES细胞,方能选择性地存活下来。然后将这些存活的ES细胞注射进小鼠早期胚胎。由于ES细胞是二倍体细胞,所以已经剔除了待剔除基因的ES细胞是该基因的杂合子,也就是ES细胞的一对同源染色体中只有一条染色体上的等位基因被剔除了。所以这种ES细胞注入小鼠胚胎后产下的小鼠也是该基因的缺失杂合体,需要把同是该基因缺失杂合体的雌雄小鼠交配,从子代中选出该基因缺失的纯合体,其概率为四分之一。这些缺失纯合小鼠可用于研究鉴定被剔除基因的生物功能。


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