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  • 基因打靶:是指通过DNA定点同源重组,改变基因组中的某一特定基因,从而在生物活体内研究此基因的功能。 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段,它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上,并促进了相关技术的进一步发展。基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。

    原理

    首先获得ES细胞系,利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性,可以发育为嵌合体动物的生殖细胞,使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系,使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。目前,在ES细胞进行同源重组已经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。通过基因打靶获得的突变小鼠已经超过千种(相关数据库参见文献),并正以每年数百种的速度增加。通过对这些突变小鼠的表型分析,许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明,并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。

    实验流程:见图片
    由上到下

    特点

    基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等,并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传,表达突变的性状,从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题,以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。

    应用

    基因打靶技术在基因功能研究中的应用、应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型、应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器等。

    诺贝尔奖获奖情况

    70岁的美国科学家马里奥·卡佩奇,82岁的美国科学家奥立佛·史密斯与66岁的英国科学家马丁·埃文斯,凭借基因打靶技术共同分享了2007年度诺贝尔生理学或医学奖。因为他们发现了如何用基因控制老鼠胚胎细胞,评委会认为,是因为其“开创了全新的研究领域”,为人类攻克某些疾病提供了药物试验的动物模型。

      “基因打靶”技术是指利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质,定向改造生物某一基因的技术。借助这一从上世纪80年代发展起来的技术,人们得以按照预先设计的方式对生物遗传信息进行精细改造。科学家可以瞄准某一特定基因,使其失去活性,进而研究该特定基因的功能。打个比方来说,使用“基因打靶”这具高精度瞄准镜,科学家们就能够精确瞄准任何一个基因,并对它进行深入研究。

       尽管“基因打靶”技术刚刚诞生20余年,全世界的科学家已经利用该技术先后对小鼠的上万个基因进行了精确研究。根据导致人类疾病的各种基因缺陷,科学家培育了超过500种存在不同基因变异的小鼠,这些变异小鼠对应的人类疾病包括心血管疾病、神经病变,糖尿病和癌症等。

       诺贝尔奖评审委员会在新闻公报中说:“今年的奖项所涉及的发现引领人们掌握了一个无比强大的研究武器:小鼠的‘基因打靶’研究技术。它如今已经被应用在生物医学所有领域。”
     
      “基因打靶”技术现在还只是起步阶段,这项技术将被越来越频繁地使用,通过系统地剔除基因,人类能够了解自身和疾病机理,掌握更有效的治疗手段。   
  • 脂质代谢关键因子CREBZF作为一个转录辅助调节因子(coregulator)通过负调控STAT3的活性,进而抑制肝组织的再生的分子机制。在肝脏受损或者部分切除的情况下,CREBZF-STAT3途径可能是一个重要的细胞内信号,防止肝脏过度再生并维持标准肝脏质量。
  • 缩略语:SKP2

  • CRISPR简介

    CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),被称为规律成簇间隔短回文重复,实际上就是一种基因编辑器,是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统,也是一种对付攻击者的基因武器。后来,研究人员发现,它似乎是一种精确的万能基因武器,可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因,这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因,这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。


    CRISPR/Cas9基因编辑器及其原理简介



    CRISPR担当细菌的防护罩

    CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族,其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游,是富含AT长度为300~500bp的区域,被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21~48bp,含有回文序列,可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26~72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成,类似免疫记忆,当含有同样序列的外源DNA入侵时,可被细菌机体识别,并进行剪切使之表达沉默,达到保护自身安全的目的。

    通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现,在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性),并且与CRISPR区域共同发挥作用,因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated),缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1~Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化,共同构成一个高度保守的系统。


    CRISPR基因组定位



    CRISPR的工作原理

    当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时,在前导区的调控下,CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA,pre-crRNA),然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA,最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。

    目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型,它们存在于大约40已测序的真细菌和90已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单,以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成,也是目前研究中最深入的类型。

    在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点,在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外,pre-crRNA转录的同时,与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA,tracrRNA)也转录出来,并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后,crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体,识别并结合于crRNA互补的序列,然后解开DNA双链,形成R-loop,使crRNA与互补链杂交,另一条链保持游离的单链状态,然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链,RuvC活性位点剪切非互补链,最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5‘‘-GG-N18-NGG-3‘‘特征区域中的NGG位点,而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明,Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒,其剪切效率堪比限制性内切酶。

    CRISPR作用原理



    由于crRNA参与并且起到精确导向的作用,所以CRISPR/Cas9打靶系统也被称为RNA导向(RNA guided)打靶系统。
  • 缩略语:KLH
  • Parthanatos,又称PARP-1 dependent cell death, 是基于DNA损伤,PARP-1激活的一种新的程序性细胞坏死形式。
    PAPR抑制剂和PARP基因敲除可以有效阻止该细胞死亡。Parthanatos (par + thanatos) 最初是由Dawson实验室根据“Par” (PARP酶活产物)和“thanatos”(希腊语死亡之神)而命名。简单地讲,当环境中的DNA损伤化学物质或氧化应激副产物损伤DNA的时候,PARP-1 过度激活,造成PAR产物的聚集,并进一步引起AIF从线粒体释放并携带MIF去细胞核,最终剪切染色体DNA,执行细胞死亡任务。
  • 必需基因(essential gene) :一些基因在突变时会引起致死表型,这些基因被称为必需基因。

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