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  • 核碱基(英语:Nucleobase)是指一类含氮碱基(nitrogenous base),在生物学上通常简单地称之碱基(base)。是在DNA和RNA中,起配对作用的部分。核碱基都是杂环化合物,其氮原子位于环上或取代氨基上,其中一部分(取代氨基,以及嘌呤环的1位氮、嘧啶环的3位氮)直接参与碱基配对。
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    表位作图
     
        早期表位作图或定位(epitopemapping)主要是采用精细的、但十分繁琐的蛋白质化学方法。这些方法是基于蛋白质修饰和降解的原理,可经侧链化学修饰法选择性地标记氨基酸,失去结合的部分将被测出。蛋白质抗原被降解为小片段,经测序后确定抗体结合的位点。虽然其结果在蛋白化学中是非常完美的例子,但是要确定某一抗原的全部表位需要大量的时间。分子克隆技术和肽链合成方法的进展极大地促进了表位作图方法的改进。现已可以通过诱变、蛋白质合成或蛋白竞争结合方法鉴定其表位。此外,表位序列测定的应用对抗体结合表位的分析具有显著的优越性。表位作图方法也可用在其他方面的研究,如蛋白质功能活性的定位,以及特殊标志的结合区分析。
    通过重组cDNA克隆的Tn5转座子诱变技术获得的疟原虫表面抗原表位作图
    质粒pEG81转座子(Tn5)表位作图:该图显示了57个独立的Tn5插入部分的位置,用Hindm消化纯化的质粒DNA,确定丁pEG81的HindⅢ酶切位点的插入突变。PEG81::Tn5—121右侧的插入能被PvuⅡ和BamHI消化,证明它们在pEG81的插入方向正确。PstI消化证实了Tn5的cDNA插入。用Psti消化pEGSl导致340bp限制性片段的消失,推测系Tn5插入该片段所致。圈中数字表示该插入对携带质粒细胞的溶解产物与2G3结合无影响,菱形内数字表示含质粒细胞溶解产物不再与抗体结合。
     
        对单克隆抗体和多克隆抗体识别蛋白质抗原表位的确定为免疫化学分析提供了十分有用的信息。表位作图方法是检测免疫反应特异性和鉴定不同抗体的重要方法。它也被用来确定相关物质的特性,如蛋白修饰位点、蛋白片段的来源或该蛋白在细胞膜上的定位。利用结合特异性表位的抗体可以对蛋白质结构域、蛋白质功能和蛋白质间相互作用体可以确定相关蛋白质在细胞内的定位,以及测定相关蛋白质的特异性或修饰其功能。
        表位作图可用于检测免疫反应特异性或不同抗体的鉴别,亦可用来确定蛋白质的特性,如蛋白质的位点、蛋白质片段的来源以及蛋白质在细胞中的定位。
        表位可根据其功能的不同分为两种不同类型:①线性表位(1inear):为小的线状肽链序列,约为5~20个氨基酸;②构象表位(conformational):由蛋白折叠而形成的较大的区域。抗原—抗体结合晶体结构研究表明存在两种类型的表位。
        线性表位的抗体结合位点与其氨基酸侧链骨架之间形成了较强的多样性结构,并与相邻的肽链序列连接在一起,这些表位也被称为连续性表位。事实上线性表位需要某些局部的结构变形或为紧密的、但并非连续的氨基酸序列,如那些兼性。螺旋结构。因此,所谓线性表位的描述是不够确切的。所有与抗体结合位点功能相关的结构,均位于一个肽链片段之中。而来自于该片段之外的其他序列,对于抗体结合位点的构成并非重要。
        构象表位宜对较大的蛋白区表位作图。这些表位表现出侧链间的相互作用,虽然在折叠蛋白质结构中构象表位彼此非常靠近,但其间被较长的线性序列相互隔开。连续性表位或接近连续性的氨基酸序列对蛋白质的降解作用有抵抗能力。而那些非连续性表位结构在蛋白质未能折叠的情况下将会失去活性,这也是两种不同表位在功能上不同的关键所在。
        在免疫印迹反应中,抗体能够识别耐蛋白降解的表位,它们在蛋白抗原上的结合位点能够被精确地定位,直到很小的肽链片段。
        构象表位的精确定位极为困难。竞争性试验可用来确定2个或2个以上的抗体是否识别相同的蛋白质抗原空间不连续表位或重叠位点。大分子蛋白质常含有50—100个氨基酸组成的不连续折叠构象。因此,利用重组DNA技术,可以定位那些构象性表位,至少可以确定其肽链片段。
  • Argonaute (AGO):一类庞大的蛋白质家族,是组成RISCs复合物的主要成员。AGO蛋白质主要包含两个结构域:PAZ和PIWI两个结构域,但具体功能现在尚不清楚。

    最近的研究表明,PAZ结构域结合到siRNA 的3’的二核苷酸突出端;一些AGO蛋白质的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性。PAZ和PIWI两个结构域,对于siRNA和目标mRNA相互作用,从而导致目标mRNA的切割或者翻译抑制过程,是必不可少的。同时,不同的AGO蛋白质有着不同的生物学功能。

    例如,在人当中,AGO2“筹划”了RISCs对于目标mRNA的切割过程;而AGO1 和AGO3则不具备这个功能。

    其它相关名词:

    Core RISC:是介导目标mRNA切割过程或者翻译抑制的最小的RNA-蛋白质复合物。在人和果蝇身上发现的分子量少于200kDa的RISCs可能就是core RISC的重要代表。AGO蛋白质和Core RISC密切相关。

    Dicer (DCR):是RNAase Ⅲ家族中的一员,主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地,我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域,最先在果蝇中发现,并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。

    Holo RISC:是在果蝇中发现的有着RISC活性的最大的RNA-蛋白质复合物(80S)。Holo RISC的生物学活性牵涉到几乎所有的RISC的成员,RLC成员,和一些其他通路上的蛋白质分子。Holo RISC的存在,表明了RISC组装不是孤立的,同时还是一个有序的过程。以RISC为中心的RNAi和miRNA通路与一些其他的通路密切联系,很可能借此调控生物体的生长发育过程。

    Microprocessor:一种核内的复合物,主要由Drosha和Pasha两者组成,在miRNA的生物合成中促使原始的miRNA成为miRNA前体。 MicroRNA (miRNA):是含有茎环结构的miRNA前体,经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(~21-23个核苷酸)。MiRNA,以及miRISCs(RNA-蛋白质复合物)在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能,miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。

     RISC loading complex (RLC):是一种促使RISC形成的复合物。RLC有方向性地调节小RNA双螺旋,为以后的RISC组装作好铺垫。最近,siRISC loading complexes (siRLCs)在果蝇中研究最多。有研究者认为在果蝇中的siRLCs包含DCR2-R2D2异型二聚体和siRNA双螺旋;R2D2部分是非对称性的感受器,为RISC组装调整好siRNA的方向。

    miRISC loading complexes (miRISCs)的研究尚未报导,因为它的过程更为复杂,而且体外研究miRLCs的方法还没有建立。

    RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing (RITS):是一种组织染色质变型的复合物。RITS复合物也包含Dicer加工形成的siRNA和AGO蛋白质,通过结合到异染色质的基因池上来促使异染色质上基因的沉默。

     RNA-induced silencing complex (RISC):一种RNA-蛋白质复合物,通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。SiRNA组装siRISC,miRNA组装miRISC。RISCs(无论siRISC还是miRISC)包括两种类型:切割型和不切割型。现在的研究表明,RISC当中的AGO蛋白质决定了RISC是切割型的还是不切割型的。

     Slicer:在切割型RISC中的内切酶的另外一种表述方法。

    Small interfering RNA (siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默。

  • 缩略语:PAMP
  • 一种通过临床下调基因表达带来的生物学功能改变的策略
  • 缩略语:NCBI

  • CRISPR简介

    CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),被称为规律成簇间隔短回文重复,实际上就是一种基因编辑器,是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统,也是一种对付攻击者的基因武器。后来,研究人员发现,它似乎是一种精确的万能基因武器,可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因,这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因,这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。


    CRISPR/Cas9基因编辑器及其原理简介



    CRISPR担当细菌的防护罩

    CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族,其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游,是富含AT长度为300~500bp的区域,被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21~48bp,含有回文序列,可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26~72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成,类似免疫记忆,当含有同样序列的外源DNA入侵时,可被细菌机体识别,并进行剪切使之表达沉默,达到保护自身安全的目的。

    通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现,在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性),并且与CRISPR区域共同发挥作用,因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated),缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1~Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化,共同构成一个高度保守的系统。


    CRISPR基因组定位



    CRISPR的工作原理

    当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时,在前导区的调控下,CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA,pre-crRNA),然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA,最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。

    目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型,它们存在于大约40已测序的真细菌和90已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单,以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成,也是目前研究中最深入的类型。

    在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点,在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外,pre-crRNA转录的同时,与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA,tracrRNA)也转录出来,并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后,crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体,识别并结合于crRNA互补的序列,然后解开DNA双链,形成R-loop,使crRNA与互补链杂交,另一条链保持游离的单链状态,然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链,RuvC活性位点剪切非互补链,最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5‘‘-GG-N18-NGG-3‘‘特征区域中的NGG位点,而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明,Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒,其剪切效率堪比限制性内切酶。

    CRISPR作用原理



    由于crRNA参与并且起到精确导向的作用,所以CRISPR/Cas9打靶系统也被称为RNA导向(RNA guided)打靶系统。

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